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分光光度计知识汇总二

提供来源:上海百贺 日期:2018年03月17日
一、测量条件的选择
 
1.1 显色反应及显色条件的选择
进行比色分析或光度分析时,首先要把待测组分转变成有色化合物,然后进行比色或光度测定。将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应
 
1.1.1 显色反应的选择
显色反应分两类,即络合反应和氧化还原反应,络合反应是主要的显色反应。
选用的原则是:
1)选择灵敏的显色反应。摩尔吸光系数ε的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志,因此应当选择生成的有色物质的ε较大的显色反应。一般来说,当ε为104-105时,可认为该反应灵敏度较高。
2)尽可能选择选择性好的显色剂。即显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。
3)显色剂在测定波长处无明显吸收。通常把两种有色物质大吸收波长之差称为对比度,一般要求显色剂与有色化合物的对比度在60nm以上。
4)反应生成的有色化合物组成恒定,化学性质稳定。
 
1.1.2 显色条件的选择
吸光光度法测定的是显色反应达到平衡后溶液的吸光度,因此要得到准确的结果,从研究平衡着手,了解影响显色反应的因素,控制适当的条件,使显色反应完全和稳定。
 
1)根据溶液平衡原理,有色络合物的稳定常数越大,显d剂过量越多,越有利于待测组分形成有色络合物。但是过量显色剂的加入有时会引起副反应,对测定反而不利。
2)酸度对显色反应的影响是多方面的。一种金属离子与某种显色剂反应的适宜酸度范围是通过实验来确定的。确定的方法是固定待测组分及显色剂的浓度,改变溶液pH值,测定其吸光度,作出吸光度-pH值关系曲线,选择曲线平坦部分对应的pH值作为测定条件。
3)显色反应一般在室温下进行,有的反应需要加热,以加速显色反应,使之进行完全。
4)大多数显色反应需要经过一定的时间才能完成,其长短与温度的高低有关,也会受到空气的氧化或发生光化学反应使眼色颜色减弱。因此通过实验作出在一定温度下的吸光度-时间关系曲线,得到适宜的显色时间。
 
1.1.3 干扰的消除
1)干扰的类型
光度分析中,
A.干扰离子本身有颜色
B.干扰离子本身无颜色,但能与显色剂反应生成稳定的配合物。若生成的配合物有色则直接干扰测定,若生成的配合物无色,也降低了显色剂的浓度,
C.干扰离子与被测离子反应生成配合物或沉淀,影响被测离子的测定。
 
2)消除干扰的方法
A.控制溶液酸度。
B.加入掩蔽剂与干扰离子形成更稳定的化合物,使干扰离子不再产生干扰。
C.里用参比溶液消除某些有色干扰离子的影响。
D.选择适当的工作波长以消除干扰。
E.采用适当的分离方法。
 
1.2 吸光度测量条件的选择
1.2.1 入射光波诺难≡瘘/div>
应根据吸收光谱曲线,选择溶液具有大吸收时的波长作为入射光的波长。
如显色剂与钴络合物在420nm波长处均有大吸收峰。如用此波长测定钴,则未反应的显色剂会造成干扰而降低测定的准确度。因此选择在500nm波长处测定,
 
3.2.2 参比溶液的选择
1)如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收,可用纯溶剂作参比溶液。
2)如果显色剂或其他试剂略有吸收,应用空白溶液
3)如试样中其他组分有吸收,但不与显色剂反应,则当显色剂无吸收时,可用试样溶液作参比溶液,当显色剂略有吸收时,可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂,以此溶液作参比溶液。
 
3.2.3 吸光度读数范围的选择
实践证明,吸光度在0.2-0.5内时,测量的相对误差小。
可用两种方法来调整被测溶液的吸光度:
1)控制被测溶液的浓度。如改变取样量,改变溶液的浓缩倍数或稀释倍数。
2)选择不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程长的比色皿,吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
 
四、应用
 
4.1 应用领域
4.1.1高含量组分测定-示差法
当待测组分含量较高时,测得任舛戎党3F肜什?比尔定律。即使不发生偏离,也因为通常采用纯溶剂作参比溶液(普通光度法),使测得的吸光度太高,超出适宜的读数范围而引入较大的误差。采用示差法就能克服这一缺点。
 
但应用示差法时,要求仪器光源有足够的发射强度或能光电流放大倍数,以便能调节参比溶液透光度为100%。这就要求仪器单色器质量高,电光学系统稳定性好。
 
4.1.2 多组分分析
应用紫外可见分光光度法,常常可能在同一试样溶液中不进行分离而测定一个以上组分。
假定溶液中同时存在两种组分x和y,其吸收光谱一般有重叠和不重叠两种情况。
1)不重叠的测定组分相互不产生干扰。
2)若吸收光谱重叠,在波长为λ1和λ2时分别测定吸光度A1和A2,由吸光度值的加和性得到联立方程,通过解联立方程求得各浓度值。
 
4.2 定量方法
紫外可见分光光度分析的定量依据是光吸收定律,但具体操作方法却有多种
 
4.2.1 标准曲线法
即工作曲线法,
根据光吸收定律,对于一种有色化合物,ε是一个定值,若把光程L也固定,那么吸光度A就和溶液的浓度c成正比,也就是说吸光度A和浓度c呈线性关系。
配制一系列适当浓度的标准溶液,显色直鸩舛ㄆ湮舛龋盐舛華对浓度c作图,即得工作曲线。
 
2.2.2 直接比较法
直接比较法其实质也是工作曲线法,是一种简化的工作曲线法。
配一个已知被测组分浓度为cs的标样,测其吸光度为As,在
As=εcsL
Ax=εcxL
由于溶液性质相同,比色皿厚度一样,所以As/Ax=cs/cx
式中:
cs-已知被测组分的浓度,mol/L;
cx-未知样品的浓度,mol/L;
As-已知被测组分的吸光度;
Ax-未知样品的吸光度。
直接比较法简化了绘制工作曲线的步骤,适用于个别样品的测定。
操作时应注意配制标样的浓度要接近被测样品的
 
2.2.3 标准加入法
标准加入法是工作曲线的一种特殊应用。
选择适当的显色条件,先测定浓度为cx的未知样品吸光度为Ax,再向未知样品中加入一定量的标样,配置成浓度为cx+Δc1、cx+Δc2……一系列样品,分别显色后再测定吸光度为A1、A2……在坐标纸上绘图,以吸光度A为纵坐标,以浓度c为横坐标,分别画出Δc1、Δc2所对应的A1、A2等各点,连成直线后延长,与横轴的交点cx也就是未知样品的浓度cs。
 
应用标准加入法时要注意,加入的标样浓度要适当,使画出的曲线保持适当角度,浓度过大或过小都会带来测量误差。
 
这种方法操作比较麻烦,不适于作系列样品分析,但它适用于组成比较复杂,干扰因素较多>又不太清楚的样品,因为它能消除背景的影响。
 
2.3 紫外可见分光光度计使用中的注意点
2.3.1 保护光源
光源灯有一定的寿命,仪器不工作时不要开灯,若工作间歇时间短,可不关灯。
一旦停>,则要待灯冷却后再重新启动,并预热15min。
灯泡发黑或亮度明显减弱或不稳定时,就及时更换。
经经紫外光照射后形成结痕可用无水乙醇去除。
 
2.3.2 保证合适的工作环境
温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。
不适宜的温度和湿度可引起机械部件的锈蚀,使金属镜面的光洁度下降,引起仪器机械部分的误差或性能下降;
 
造成光栅、反射镜、聚焦镜等光学部件的铝膜锈蚀,产生光能不足、杂散光、噪声等;
甚至使仪器停止工作,从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正温度和湿度。
 
实验室,特别是地处南方地区的实验室,应具备四季恒温的仪器室,配备恒温设备。
环境中的尘埃和腐蚀性气体也可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电耦合器的可靠性,也是造成光学部件铝膜锈蚀的原因之一。
 
因此定期清洁,保障环境和仪器内卫生条件,防尘。
 
2.3.3 定期除尘、调校
 
2.3.4 正确使用比色皿
拿比色皿时,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。
清洗比色皿时,先用水冲洗,再用蒸馏水洗净。若被比色皿被有机物沾污,可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1:2)浸泡片刻,再用水冲洗。每次做完实验应立即洗净比色皿。
比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干,以保护透光面。
 
测定有色溶液吸光度时,一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次,以免改变有色溶液的浓度。在测定一系列溶液的吸光度时,通常都按由稀到浓的顺序测定,以减少测量误差。
若分光光度计噪音比较大,有可能是光源灯泡使用时间超过寿命期,可更换光源灯泡。
若自检时提示波长自检出错,有可能是自检过程中打开过仪器样品室的盖子,